Zdroje preanalytické variability lze charakterizovat jako zdroje ovlivnění výsledku vyšetření, které se vyskytují:
před odběrem biologického materiálu
při odběru biologického materiálu
mezi odběrem biologického materiálu a analýzou
Výsledky měření in-vitro nereprezentují aktuální koncentrace, aktivity nebo počty vyšetřovaných komponent v systémech in-vivo. Zdroje odchylek leží v preanalytické fázi, ve vlastním analytickém procesu i ve fázi postanalytické. Preanalytické vlivy jsou významné a řadu z nich lze minimalizovat.
Základní pojmy
|
centrifugace |
významný zdroj preanalytické variability, uplatňující se samostatně (vliv hodnoty g, vliv doby centrifugace, vliv úhlu rotoru, vliv teploty) i v kombinaci s jinými faktory (vliv separačních gelů) |
|
cirkadiánní variace |
pravidelně se opakující jev s periodou přibližně 24 hodin (rytmická změna koncentrace, aktivity nebo počtu komponent, kterou je možné predikovat během časového intervalu přibližně 24 hodin) |
|
cirkanuální variace |
pravidelně se opakující jev s periodou přibližně jednoho roku (rytmická změna koncentrace, aktivity nebo počtu komponent, kterou je možné predikovat během časového intervalu přibližně jednoho roku) |
|
cyklické variace |
pravidelně se opakující jev s predikovatelnou periodou |
|
gelové separátory |
možný zdroj preanalytických problémů způsobených chemickými a mechanickými vlastnostmi gelu a adsorpcí některých látek na gely |
|
hemolýza |
proces rozpadu erytrocytů, modifikující vzhled a složení plazmy, významný zdroj preanalytické variability |
|
infradiánní variace |
pravidelně se opakující jev s periodou delší než 24 hodin (rytmická změna koncentrace, aktivity nebo počtu komponent, kterou je možné predikovat během časového intervalu delšího než 24 hodin) |
|
intraindividuální variabilita |
variabilita podmíněná fyziologickými a patologickými změnami, které se týkají individua, variabilita s vysokým podílem genetického pozadí, významná součást tzv. kritické diference |
|
interindividuální variabilita |
variabilita podmíněná fyziologickými a patologickými rozdíly mezi jedinci, variabilita ovlivňující šířku referenčních rozmezí |
|
kritická diference |
rozdíl mezi dvěma po sobě jdoucími výsledky měření, který lze při určité úrovni analytické variability a intraindividuální variability označit za významný se zvolenou pravděpodobností, obvykle 95 % |
|
protisrážlivá činidla |
významný zdroj preanalytické a analytické variability způsobený chemickými vlivy, dilucí, interferencemi a dalšími vlivy |
|
turniket |
významný zdroj preanalytické variability, podílející se na změně kvality vzorku řadou mechanismů (hemolýza, hypoxie, změna podmínek pro fyziologické uplatnění Starlingova zákona a další) |
|
ultradiánní variace |
pravidelně se opakující jev s periodou mnohem kratší než 24 hodin (rytmická změna koncentrace, aktivity nebo počtu komponent, kterou je možné predikovat během časového intervalu mnohem kratšího než 24 hodin) |
Mezi NEOVLIVNITELNÉ FAKTORY preanalytické variability u pacientů patří:
cyklické variace (cirkadiánní, cirkanuální, infradiánní, ultradiánní) jsou periodické jevy, které lze s určitou nejistotou predikovat. Kromě toho existuje intraindividuální variabilita, jejíž hlavní složkou jsou necyklické, nepredikovatelné variace, které na cyklické variace dále nasedají. Intraindividuální variabilitu lze minimalizovat pomocí opakovaných odběrů, je tedy relativně neovlivnitelným zdrojem variability. Existuje databáze intra- a interindividuální variability. Intraindividuální variabilita se využívá pro výpočet kritických diferencí.
pohlaví, rasa a věk jsou další neovlivnitelné faktory. Rozdíly v koncentracích, aktivitách nebo počtech komponent mezi pohlavími se mění s věkem. Rozdíly jsou dány především hormonálním vybavením a habitem (větší svalová hmota u většiny mužů a z toho vyplývající rozdíly závislých ukazatelů). V době pohlavní zralosti mohou být rozdíly maximální, v raném věku a ve stáří se mohou rozdíly stírat. Důkladná znalost referenčních rozmezí pro obě pohlaví závažnost problému snižuje, ale neodstraňuje. Příliv migrantů způsobil v posledních letech zpestření dosud relativně homogenní kavkazské populace v České republice a je nutné o existujících rozdílech sbírat informace. Vzhledem k nutnosti odebírat biologický materiál kdykoli během života nelze plánovat prakticky žádné vyšetření do určitého věkového pásma a věk proto jako neovlivnitelný faktor může být pouze předmětem věkově specifických referenčních mezí. Platnost referenčních mezí přebíraných z literatury je nutné ověřit pro analytické metody používané v konkrétní laboratoři a pro cílovou populaci.
u krevního srážení hraje důležitou roli i zralost jaterního parenchymu (novorozenci) a změna koagulační rovnováhy (změna D-dimeru ve vyšším věku). U krevní skupiny 0 snížení krevního faktoru VIII a von Willebrandova faktoru.
gravidita je mimořádným zdrojem mechanismů, které vedou ke změnám koncentrací, aktivit nebo počtu komponent během gravidity. Jedná se například o změnu produkce hormonu (hCG, estriol, lidský placentární laktogen), zvýšení produkce vazebných proteinů (a následné zvýšení koncentrace kortizolu a tyreoidálních hormonů), zvýšení plazmatického objemu (z hodnoty přibližně 2600 ml na hodnotu až 3900 ml, ovlivněny jsou proto plazmatické proteiny, tento efekt se také podílí na poklesu početní koncentrace krevních elementů), zvýšení glomerulární filtrace (o 50 %), zvýšení objemu moče (s poklesem koncentrací řady látek, ale jejich odpady se měnit nemusejí), vliv placenty (zvýšení podílu placentární ALP), přestup analytu z plodové vody, změna koagulace (zvýšení hladiny fibrinogenu, koagulacních faktorů VII, VIII, X, XII, von Willebrandova faktoru, snížení hladiny faktoru XI, XIII, proteinu S, změny fibrinolytického systému, vzestup PAI2 a zvýšení hladiny markerů aktivace koagulace), v krevním obraze je mírná leukocytóza, často neutrofílie, normocytární anémie, zvýšení transportních plazmatických proteinů (T4, lipidy, měď, ceruloplazmin), relativní deficity při zvýšených požadavcích (pokles koncentrace železa, transferinu), zvýšení reaktantů akutní fáze, zvýšení sedimentace erytrocytů (až 5x), přesun směrem k anabolizmu (pokles urey) a další.
Mezi OVLIVNITELNÉ FAKTORY preanalytické variability u pacientů patří:
fyzická zátěž před odběrem biologického materiálu
vliv diety, resp. vliv hladovění
vliv léků, které se uplatňují v preanalytické fázi více mechanismy: indukce jaterních enzymů (barbituráty a fenytoin), interference s analytickým principem (amiodaron ovlivňuje stanovení tyroidálních hormonů, interakce (beta-laktamy a aminoglykosidy), zvýšení estrogenní aktivity (hormonální antikoncepce, dochází ke zvýšení vazebných proteinů pro tyroxin, kortizol, měď, zvyšuje se SHBG, snižuje se hladina proteinu S, je rezistence na aktivovaný protein C, zvyšuje se hladina von Willebrandova faktoru), kortikoidy způsobují leukocytózu, asparagináza snižuje fibrinogen, faktory IX, X, XIII, valproát snižuje von Willebrandův faktor, faktor VIII, faktor IX. Antagonisté K vitamínu snižují hladinu K-dependentních faktorů. Podrobnější údaje je nutné hledat ve specializovaných monografiích (Young et al., AACC Press).
nadmořská výška, kdy například u osob pobývajících ve výškách nad 3000 m je již možné pozorovat adaptaci na výšku. Jedná se o zvýšení 2,3 - bisfosfoglycerátu, hematokritu, hemoglobinu, CRP a urátu. Snižuje se naopak clearance kreatininu (ze snížení eliminace kreatininu, ve velkých výškách je výrazný podíl dehydratace), snižuje se plazmatická koncentrace estriolu, reninu a transferinu, snižuje se osmolalita plazmy. Déletrvající hypoxie je spojena s hypokapnií s poruchou stimulace dýchacího centra.
mechanické trauma, kdy příkladem může být zvýšení plazmatické koncentrace PSA po digitálním vyšetření prostaty, po jízdě na kole nebo při obstipaci, zvýšení myoglobinu, CK, AST a ALT po svalovém traumatu včetně opakovaných intramuskulárních injekcí nebo po zvýšené fyzické zátěži (např. intenzivní cvičení v posilovně apod.), zvýšení ALT tlakem dělohy ve vysokém stupni gravidity. Do této skupiny lze řadit také mechanickou hemolýzu erytrocytu po maratónském běhu, u chodců na dlouhých tratích nebo při chlopenních vadách. Do této skupiny lze zařadit i extrakorporální oběh a popáleniny. Mechanické trauma rovněž zvyšuje hladiny fibrin/fibrinogen degradačních produktů (FDP, D-dimeru).
stres, který zvyšuje renin, aldosteron, somatotropin (GH), katecholaminy, kortikotropin (ACTH), kortizol, glukagon, paratyrin, prolaktin a další hormony. V rámci stresu se mění i koncentrace dalších analytů: cholesterol po akutním infarktu myokardu klesá během 24 hodin a dosahuje snížení o 60
% proti výchozí hodnotě a opětovné zvýšení je otázkou řady týdnů. Mírný stres ale muže koncentraci cholesterolu zvýšit. U nemocných v intenzívní péči může klesat produkce hypofyzárních hormonů a aldosteronu. Významným stresem je probuzení, proto například odběr krve na stanovení koncentrace prolaktinu je možné provést 3 hodiny po probuzení. Pooperační stres snižuje tyreoidální hormony, snižuje transferin a sekundárně zvyšuje feritin. Dochází k vzestupu faktoru VIII, von Willebrandova faktoru, leukocytů - relativní neutrofílie, lymfopenie.
Zdroje preanalytické variability při odběru biologického materiálu musí znát a minimalizovat každý pracovník, který se na odběru materiálu podílí. Laboratoř musí ve spolupráci se svými klienty zajistit, aby byla na všech odběrových místech k dispozici instrukce v písemné formě o správném odběru jakéhokoli biologického materiálu. Tato instrukce musí obsahovat také údaje o zdrojích preanalytické variability při odběru.
Mezi ZDROJE PREANALYTICKÉ VARIABILITY PŘI ODBĚRU patří:
načasování odběru krve: speciální problematiku, kdy načasování odběru je klíčové, tvoří funkční testy a monitorování farmakoterapie. Při monitorování léku je nutné čas odběru určit s ohledem na poločas eliminace léku. U léku s krátkým poločasem (poločas v desítkách minut, například aminoglykosidová antibiotika) jeden odběr nestačí, je nutné odebrat v čase předpokládaného peaku a v čase před další dávkou, nebo vícekrát pro určení plochy pod křivkou. U léků s delším poločasem (více hodin až dnů) postačuje obvykle odběr před další dávkou. Je nutné počítat s tím, že steady - state se dosahuje po 6 - 7 poločasech.
poloha při odběru: ve vzpřímené pozici stoupá hydrostatický tlak a dochází k přesunu vody a iontů z plazmy do intesticia se zvýšením proteinů a krevních elementů, které kapilární stěnou neprocházejí. Výsledkem je nejen zahuštění plazmy, ale také tzv. posturální stres, aktivace sympatiku a osy renin-angiotenzin-aldosteron s příslušnou fyziologickou odpovědí. Rozdíl v koncentraci proteinů ve vzpřímené poloze proti poloze vsedě po dobu 15 minut je 5 až 8 %. Rozdíl mezi polohou vstoje a vleže se udává kolem 10, ale i 20 %. Vzestup se týká i látek na proteiny vázaných (kalcium, cholesterol), lipoproteinů, hormonů (kortizol, tyroxin), léků atd. Pro zajištění standardních podmínek odběru krve z loketní žíly je vhodné pro stanovení většiny analytů zajistit polohu vsedě po dobu 15 minut před odběrem, delší interval se doporučuje například u natriuretických peptidů (20 - 30 minut), pro vyšetření osy renin-angiotenzin-aldosteron je nutný noční odpočinek vleže bez jakékoli změny polohy před odběrem.
výběr místa odběru krve: nevhodná je strana, na které byla provedena mastektomie (lymfostáza), místo s hematomem, velkými jizvami, paže se zavedenou infúzí.
použití turniketu: naložení turniketu nad místem odběru sice usnadní odběr venózní krve dilatací žíly, ale vede k ovlivnění kvality vzorku. Již po jedné minutě se do intersticia přesune významné množství vody s ionty a výsledkem je zvýšení početní koncentrace elementů, zvýšení koncentrace proteinů a látek na buňky a proteiny vázaných. Po třech minutách naložení turniketu stoupá koncentrace proteinů o 5 až 8 %, po 15 minutách stoupá koncentrace proteinů až o 15 %. Dalším důsledkem přiložení turniketu jsou metabolické změny hemostázy (uvolnění tkáňového faktoru a aktivace hemostázy). Pro některá vyšetření, např. agregace trombocytů, je dokonce doporučeno krev nechat nakapat, aby se zamezilo aktivaci. V ischemizované tkáni končetiny se zvyšuje produkce laktátu a proteinů, které se po uvolnění turniketu dostávají do žíly a jsou příčinou zvýšení koncentrace těchto látek. Pokud je vůbec nutné turniket používat, neměla by doba naložení turniketu přesáhnout 15 sekund, v žádném případě však 1 minutu. Je-li turniket naložen před odběrem za účelem volby místa vpichu, lze ho pro vlastní odběr použít nejméně po dvou minutách uvolnění. Odběry před a po stažení paže se naproti tomu využívají k vyšetření fibrinolýzy.
vliv cvičení paží při naloženém turniketu: vede ke zvýšení draselného kationtu v plazmě. Cvičení ("pumpování") se obecně při odběru venózní krve nedoporučuje.
vliv lokálního metabolismu: lokální metabolizmus v místě odběru ovlivňuje zejména acidobazické ukazatele. Hypoxie paže (lokální změna metabolizmu například při prochladnutí končetiny nebo poruše oběhu) zvyšuje koncentraci laktátu, snižuje pH a zvyšuje pCO2. Pokud se provádí odběr kapilární krve na pH a krevní plyny z prstu, je vhodné paži prohřát (zabalením do teplé látky). Dochází-li k centralizaci oběhu, je rozdíl mezi arteriálními a "periferními" krevními plyny cennou informací o periferní hypoxii. Lokální metabolizmus je důvodem rozdílu mezi koncentracemi, aktivitami nebo parciálními tlaky komponent v arteriální a venózní krvi. Vychytávání glukózy tkáněmi nebo spotřeba kyslíku je příčinou pozitivního rozdílu koncentrace glukózy nebo pO2 mezi arteriální a venózní krví, tvorba pCO2, amoniaku nebo organických kyselin je příčinou negativního rozdílu koncentrací mezi arteriální a venózní krví.
hemolýza: je jednou z nejčastějších příčin ovlivnění výsledku laboratorních vyšetření, která se uplatní uvolněním látek z hemolyzovaných erytrocytů i analytickou interferencí vlivem změněného zabarvení plazmy.
vliv protisrážlivých činidel: zásadní chybou je volba nevhodného protisrážlivého činidla (při použití heparinu nelze vyšetřit koagulaci) anebo nedodržení poměru mezi krví a protisrážlivým činidlem, protisrážlivá činidla se specificky mohou uplatnit také při stanovení osmolality a dalších analytů.
kontaminace dezinfekčním činidlem: přichází v úvahu při kapilárním odběru krve, při kterém je plocha kontaminované kůže v dostatečném kontaktu s kapkou kapilární krve. Týká se to zejména odběru kapilární krve na pH.
kontaminace intersticiální tekutinou: ke které dochází při odběru kapilární krve punkcí kůže (prst, ucho, patička), pokud je kapilární krev vypuzována nadměrným tlakem v okolí punkce. Intersticiální tekutina neobsahuje proteiny (a samozřejmě ani krevní elementy), takže při kontaminaci dochází k diluci proteinových komponent a komponent vázaných na proteiny. Jediným vhodným způsobem je volné odtékání kapilární krve do odběrového zařízení (kapiláry).
kontaminace infúzí: kdy se obecně nedoporučuje odběr krve z katetru, který je určen pro podávání nitrožilní výživy. Bezpečným není odběr pod stejným turniketem ani v případě zdánlivé dostatečné vzdálenosti místa odběru a nitrožilního katetru. Příčinou kontaminace může být nejen zředění vzorku aplikovanou infúzí (v případě, že se tento způsob odběru vzorku použije), ale také zředění vzorku heparinovým zámkem katetru pro opakované odběry nebo přítomnost anastomóz v žilním řečišti. V případě použití heparinového zámku (heparinové zátky) je i po jeho odstranění ovlivněno vyšetření koagulace. Kontaminace infúzí se dále projeví atypickým, často několikanásobným zvýšením těch analytů, které byly v infúzi ve vysoké koncentraci, dilucí analytu s typickou koncentrací v plazmě, vzácněji interferencí s analytickou metodou (týká se zejména kontaminace infuzně podávanými léky). Tyto problémy se rovněž týkají koagulačních vyšetření. Pro prevenci těchto obtíží je jediným bezpečným způsobem odběr žilní krve z opačné končetiny nebo opačné strany, než je zaveden katetr infúze. Po transfúzi lze nalézt zvýšení folátu a feritinu. Po transfúzi rovněž dojde ke zkreslení výsledku vyšetření krevního obrazu.
vliv srážení: během koagulace krve uvolňují trombocyty draselný kationt, takže koncentrace draselného kationtu v séru je o 0,2 až 0,3 mmol/l vyšší než koncentrace v plazmě. Fosfáty v séru jsou vyšší o 0,06 mmol/l než v plazmě (příčina není jasná). Pozdní tvorbu fibrinu v separovaném séru odstraňuje použití aktivátoru srážení. I jen částečně vysrážený vzorek (špatný poměr protisrážlivých činidel, aktivace koagulace) zkresluje, až znemožňuje vyšetření parametrů krevního obrazu včetně diferenciálního rozpočtu a krevního srážení.
vliv konzervačních látek: (z různých příčin: intereference s analytickou metodou, změna matrice vzorku, ovlivnění analytu a podobně). Pro většinu koagulačních vyšetření je nutný nesmáčivý povrch - speciálně upravený plast, ev. silikonované sklo. Některá speciální vyšetření vyžadují i speciální odběrové nádobky (pro vyšetření trombocytárních parametrů jsou např. přidávány látky stabilizující krevní destičky).
vliv gelových separátorů
vliv materiálu odběrové nádobky: pro většinu analytů není rozhodující, zda se použije sklo nebo plast. Plast má méně smáčivý povrch a pro získání plazmy je potřebné menší množství protisrážlivého činidla. Pro speciální metody je nutné použitý materiál odběrových nádobek otestovat. Některé látky (kortikotropin, léky) se vážou na sklo.
vliv separace elementů: vhodná je centrifugace při 1000 - 1500 g po dobu 10 minut při 20 - 25°C, při 1000 - 1500 g po dobu 10 minut při 2 - 8 °C (osteokalcin, PTH, kortikotropin, natriuretické peptidy, další), axiální centrifugace (zkrácení času centrifugace). U vyšetření hemostázy volíme centrifugaci, ev. další postupy v závislosti na tom, zda k vyšetření potřebujeme plazmu bohatou na destičky (PRP - 10 minut při 150 až 250 g) nebo plazmu chudou na destičky (PPP - 10 až 15 minut při 2500 g) nebo plazmu bez destičkové (např. při vyšetření lupus antikoagulans může při dvojnásobné centrifugaci dojít k rozbití trombocytu a tím k falešně negativním výsledkům, proto se při přípravě bez destičkové plazmy doporučuje filtrace přes trombocytární filtry).
ostatní vlivy: (skladování, vliv teploty, vliv pH moče, vliv transportu, změna analytu v čase a další) jsou předmětem údajů u jednotlivých komponent. Do této skupiny patří i vliv chladových či tepelných protilátek, kdy dochází ke změnám vlastností krevních elementů.
