Laboratorní příručka ÚLM-OKB

a) Komplexní vyšetření likvoru

Základní vyšetření - provádí se statimově:

• stanovení celkové bílkoviny kvantitativně
• stanovení glukózy
• stanovení laktátu
• počet mononukleárů, polynukleárů a erytrocytů ve Fuchs-Rosenthalově komůrce
• zhotovení cytologického preparátu – základní barvení, kvalitativní hodnocení
• spektrofotometrie likvoru

Speciální vyšetření:

• cytologický preparát barvený na železo
• cytologický preparát barvený na lipidy
• stanovení albuminu v séru a v likvoru s hodnocením funkce hematolikvorové bariéry
• stanovení IgG, IgA, IgM v séru a likvoru s výpočtem intrathekální syntézy imunoglobulinů dle Reibera
• izoelektrická fokusace se specifickou imunodetekcí oligoklonálních IgG pásů
• stanovení dalších specifických proteinů: volné lehké řetězce kappa (S, CSF)-výpočet indexu
• stanovení tumorových markerů: beta-2-mikroglobulin,CEA

Průkaz likvorey:

• průkaz beta-2-transferinu (elektroforéza s následnou imunofixací)

Indikace vyšetření likvoru:

• míšní onemocnění (kompresivní syndrom)
• onemocnění zánětlivá (meningitida, encefalitida, myelitida)
• zánětlivě – autoimunitní demyelinizační onemocnění (roztroušená skleróza - RS, syndrom Guillain-Barré - GBS)
• systémová autoimunitní onemocnění (vaskulitidy, SLE)
• náhlé cévní mozkové příhody (ischemické a hemoragické ikty)
• degenerativní onemocnění (Alzheimerova choroba, amyotrofická laterální skleróza, Parkinsonova choroba)
• onemocnění nádorová

Odběr:

• likvor získáváme nejčastěji lumbální punkcí, méně často punkcí subokcipitální nebo ventrikulární
• likvor je nutné doručit do laboratoře ihned po odběru (nelze použít potrubní poštu!)
• cytologická a některá biochemická vyšetření je třeba provést nejpozději do 1 hodiny od odběru, jinak dochází k rozpadu buněk, falešnému snížení koncentrace glukózy a zvýšení koncentrace laktátu
• stabilita se snižuje s rostoucím počtem buněk v likvoru, krvavý likvor by měl být odebrán postupně do 3 zkumavek po 1 - 2 ml
• centrifugace a oddělení supernatantu je třeba udělat do 10 min od odběru
• ke zhodnocení hematoencefalické bariéry a intratékální syntézy imunoglobulinů je zapotřebí zaslat současně vzorek krve.

b) Kvantitativní stanovení jednotlivých bílkovin

Stanovení jednotlivých proteinových frakcí provádíme obvykle imunoturbidimetricky nebo imunonefelometricky. Vždy je nutné paralelně stanovit příslušné proteiny i v séru a numericky zhodnotit jejich kvocienty.

• ALBUMIN

Albumin je syntetizován v játrech. Do likvoru se dostává pouze přestupem přes hematoencefalickou bariéru, částečně přestupuje i za fyziologického stavu. Albuminový kvocient používáme k hodnocení funkce (stupně postižení) hematolikvorové bariéry a k výpočtu intratékální syntézy imunoglobulinů podle Reibrova vztahu.

Koncentrace albuminu v likvoru závisí na věku, rychlosti cirkulace likvoru, místě odběru. Poruchu hematolikvorové bariéry podle albuminového kvocientu (Qalb) hodnotíme následovně:

Qalb = 7,3 - 10,0×10-3     → mírně porušená Qalb = 10,0 - 20,0×10-3 → středně porušená Qalb = 20,0×10-3                     → těžce porušená

• Mírná porucha - je častým nálezem u roztroušené sklerózy (RS), chronických neuroinfekcí, kontuzí
• Střední porucha - např. serózní meningitidy, CMP, tumory
• Těžká porucha - bakteriální meningitidy, herpetické meningitidy, tuberkulózní meningitidy, neuroboreliózy, GBS, kompresivní syndrom

• IMUNOGLOBULINY

Zdrojem imunoglobulinů v likvoru je buď sérum, odkud přejdou při poruše hematolikvorové bariéry (závisí tedy na její funkčnosti a sérové hladině imunoglobulinů) nebo lokální syntéza přímo v likvorovém prostoru při onemocnění CNS spojeném s imunitní reakcí. K určení původu používáme Q albuminu a Q příslušného imunoglobulinu, jejichž vztah je vyjádřen Reiberovou hyperbolickou funkcí.

Intrathekální syntézu Ig nacházíme nejčastěji u RS (zejm. IgG) a jiných zánětů centrálního nervového systému (CNS). U akutních neuroinfekcí nebývá v době odběru vzorku vyjádřena, často však je nacházena u neuroborreliózy (IgM + IgG), neurosyfilis, HIV encefalopatie. Častá je také u autoimunitních zánětů CNS (autoimunitní encefalitidy, paraneoplastické neurologické syndromy, popř. systémová autoimunitní onemocnění s postižením CNS). Intrathekální syntéza Ig nebývá přítomna u polyradikuloneuritidy (GBS).

• IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE BÍLKOVIN

Využívá se k průkazu oligoklonálních proužků IgG v likvoru. Dělení probíhá v elektrickém poli v gradientu pH podle izoelektrického bodu jednotlivých bílkovin. Současně se vždy analyzuje sérum. Významný je nález oligoklonálních pruhů v likvoru, které chybějí v séru - znamená to lokální syntézu IgG. Pokud jsou pruhy přítomné zrcadlově v séru i v likvoru - znamená to systémovou imunitní reakci a pasivní přestup oligoklonálních IgG z krve do likvoru.

Při hodnocení nálezu používáme klasifikaci podle mezinárodních doporučení (Andersson et al. 1994, Freedman et al. 2005):

• Typ 1 – normální nález, jen polyklonální IgG, žádné IgG pásy v likvoru ani v séru Typ 2 – oligoklonální IgG pásy v likvoru (2 nebo více pásů), žádné IgG pásy v séru
• Typ 3 – oligoklonální IgG pásy pouze v likvoru a zároveň společné IgG pásy v likvoru i séru Typ 4 – oligoklonální IgG pásy společné v likvoru i v séru
• Typ 5 – monoklonální IgG – několik pásů v úzkém rozmezí pH gradientu společných v likvoru i séru (nález odráží pasivní přestup monoklonálního IgG z krve do likvoru a neznamená intrathekální syntézu monoklonálního IgG!)
• Slabé pásy v séru, které mají evidentně výraznější protějšek v likvoru, se v séru nepočítají.

Nález jediného IgG pásu v likvoru bez protějšku v séru je hraniční, může však poukazovat na počínající intrathekální syntézu. Pacienty s tímto nálezem je třeba sledovat a v případě potřeby zvážit kontrolní odběr (zpravidla ne dříve než za 6 měsíců).

Průkaz lokální syntézy IgG detekcí oligoklonálních IgG pásů metodou izoelektrické fokusace je senzitivnější než výpočet intrathekální syntézy IgG podle Reibera. Mohou tedy být nalezeny i v případech, kdy je výpočet podle Reibera negativní. Opačná situace (pozitivní výpočet a negativní oligoklonální IgG pásy) by nastat neměla, nejde-li o krví kontaminovaný likvor.

c) Cytologické vyšetření likvoru

• Počet elementů

Cytologické vyšetření je nutné provést nejpozději do 1 hodiny po odběru, v opačném případě dochází k rozpadu buněčných elementů. Hodnocení počtu elementů provádíme ve Fuchsově-Rosenthalově komůrce.

Stanovíme počet erytrocytů, polynukleárů a mononukleárů po obarvení kyselým fuchsinem. Za normální počet elementů lze považovat 0 - 3/µl (detailnější referenční meze v tabulce níže) - tehdy hovoříme o oligocytóze. Je-li počet elementů vyšší, označuje se jako pleocytóza. Avšak i při normálním počtu elementů může být patologická celulární skladba - jedná se pak o patologickou oligocytózu.

Referenční meze pro počet elementů (jaderných buněk) v likvoru (upraveno podle Wick et al. Methodenkatalog. Německá společnost pro likvorovou diagnostiku a klinickou neurochemii /DGLN/, Mnichov 2020. www.dgln.de )

• Morfologie a funkce elementů

K přesnější diferenciaci elementů je třeba zhotovit trvalý cytologický preparát alespoň v základním barvení po předchozím zahuštění likvoru. Jako základní barvení trvalých cytologických preparátů se používá barvení podle Pappenheima. Fyziologicky jsou v likvoru přítomny pouze mononukleáry, patologický je výskyt erytrocytů, segmentů (výjimkou je arteficiální krvácení či novorozenecký likvor).

Typy buněk v mozkomíšním moku:

• Polynukleáry - zodpovědné za nespecifickou imunitní reakci, nachází se v tkáni na počátku jakéhokoliv patologického procesu a u extracelulárních agens.
• Monocyty - jsou součástí monocyto-makrofagického systému, jsou odpovědné také za nespecifickou imunitní reakci. Uplatňují se u intracelulárních agens (viry, některé bakterie, plísně, paraziti) a při poškození vlastních buněk.
• Lymfocyty - odpovědné za specifickou imunitní reakci (pomalá, získaná, po specifickém rozpoznání antigenu, s imunologickou pamětí)

Typy cytologických likvorových nálezů:

• Granulocytární pleocytóza - bakteriální záněty
• Granulocytární oligocytóza - iniciální fáze serózních zánětů, mozková ischemie
• Lymfocytární pleocytóza - virové infekce nebo tzv. bakteriální s virovým obrazem (borelie, leptospiry aj.), mírná lymfocytární pleocytóza je častá také u RS
• Lymfocytární oligocytóza - často u RS
• Tumorózní pleocytóza - maligní meningeální infiltrace (hematologické malignity), primární nádory nebo metastázy